Первичная структура ДНК

Структура нуклеиновых кислот лучше изучена у простейших живых существ – прокариот. К ним относятся бактерии, синезеленые водоросли, риккетсии и микоплазмы. В клетках прокариот содержится единственная хромосома, состоящая из одной молекулы ДНК, которая не отделена от цитоплазмы мембраной. Наиболее подробно исследована структура нуклеиновых кислот, выделенных из различных штаммов и мутантов E. coli и ее бактериофагов. Позднее начали изучать генетический материал эукариотических клеток. К ним относятся клетки животных, растений, грибов, простейших, большей части видов водорослей. Эукариотические клетки содержат ядро, окруженное мембраной. Ядерный материал распределяется между несколькими хромосомами, основу которых составляют ДНК и белки (главным образом, гистоны). 

ДНК, подобно белкам, имеет первичную, вторичную и третичную структуры. Последовательность чередования нуклеотидов в полинуклеотидной цепи ДНК составляет ее первичную структуру. Определение первичной структуры ДНК оказалось крайне сложной и трудной задачей, так как размеры молекулы огромны, а нуклеотиды бывают всего четырех видов. Больших успехов в изучении структуры ДНК достигли Э. Чаргафф и сотрудники его лаборатории, которые, используя метод хроматографии, впервые (1950) определили нуклеотидный состав ДНК, выделенной из разных объектов. Они установили, что соотношение в ДНК азотистых оснований подчиняется универсальным закономерностям, которые получили название правила Чаргаффа. 

1. Сумма пуриновых нуклеотидов (Пур) равна сумме пиримидиновых нуклеотидов (Пир) (Пур = Пир, или Пур/Пир = 1). 

2. Молярное содержание аденина равно молярному содержанию тимина (А = Т, или А/Т = 1). 

3. Молярное содержание гуанина равно молярному содержанию цитозина (Г = Ц, или Г/Ц = 1). 

4. Количество аденина и цитозина равно количество гуанина и тимина (А+Ц = Г+Т, или А+Ц/Г+Т = 1). 

5. В ДНК из различных источников неодинаково соотношение нуклеотидов: у одних преобладает содержание аденина над гуанином, тимина над цитозином (А+Т > Г+Ц) – это так называемый АТ-тип ДНК; у других преобадают гуанин и цитозин над аденином и тимином (Г+Ц > А+Т), это – ГЦ-тип ДНК. Таким образом, ДНК из различных источников отличается по нуклеотидному составу, что выражается различной величиной отношения Г+Ц/А+Т. В связи с этим Чаргафф выдвинул положение о видовой специфичности ДНК по нуклеотидному составу. Этот вопрос был глубоко и всесторонне исследован в лаборатории А.Н. Белозерского, где были проведены обширные исследования нуклеотидного состава обоих типов нуклеиновых кислот сначала у представителей различных групп бактерий, а затем и у других организмов: водорослей, грибов, высших растений и животных. Школой А.Н. Белозерского была составлена уникальная, наиболее полная ДНК почти всех таксономических групп организмов и установлено, что нуклеотидный состав ДНК может служить одной из характеристик в эволюционной систематике организмов. Советская наука заняла лидирующее положение в области геносистематики. 

Эти исследования на огромном экспериментальном материале показали, что внутри ряда систематических групп нуклеотидный состав ДНК специфичен для каждого вида, Установлено, что у большинства животных преобладает АТ-тип строения ДНК. У бактерий наблюдается разброс нуклеотидного состава от сильно выраженного ГЦ-типа до АТ-типа. Нуклеотидный состав ДНК бактерий используют в настоящее время как один из систематических признаков в исследованиях по таксономии. Этот признак позволяет уточнять родство отдельных бактериальных видов, решать спорные вопросы классификации. Однако даже при одинаковом количественном соотношении А, Т, Г, Ц строение ДНК может быть различным, поскольку оно обусловлено также последовательностью расположения нуклеотидов. Разработка методов определения последовательности нуклеотидов, т.е. первичной структуры, была следующим этапом в изучении ДНК. 

В течение ряда лет о первичной структуре ДНК, точнее ее отдельных фрагментов, судили по косвенным данным: по сблочнности пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, по распределению минорых азотистых оснований, по особенностям физических свойств. Перелом в этой области наметился в 70-ых годах в связи в усовершенствованием метода электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) и с открытием ферментов рестриктаз. 

Рестриктазы были применены для разделения молекул ДНК на фрагменты, поскольку рестриктаза «разрезает» молекулу ДНК в строго определенных точках, там, где расположены специфические последовательности нуклеотидов. Разные ретриктазы «узнают» разные последовательности. Используя эти ферменты, можно «разрезать» молекулу ДНК на множество фрагментов, концевые последовательности которых известны, поскольку они зависят от вида использованной рестриктазы. Полученные фрагменты разделяют методом электрофореза в ПААГ. Молекула ДНК несет отрицательный заряд, обусловленный диссоциацией фосфатных групп, пропорциональной по величине длине цепочки, поэтому передвигается в электрическом поле. Разделение фрагментов молекулы происходит вследствие различий в величине их заряда и размерах. Благодаря этому разрешающая способность метода оказалась настолько высока, что позволяет отделять друг от друга фрагменты ДНК, отличающиеся по длине на одно мономерное звено. Например, можно разделить фрагменты длиной в 98, 99 и 100 нуклеотидов. Гель разрезают так, чтобы каждый кусочек содержал одну полоску, одно скопление фрагментов ДНК. 

Последовательности нуклеотидов в коротких фрагментах ДНК определяют с помощью ряда методов. Идея одного из них была предложена советским ученым Е.Д. Свердловым (1972-1973). Окончательно она была реализована американскими учеными А. Максамом и В. Гилбертом (1977). Исходным материалом является образец, состоящий из тождественных друг другу однонитевых фрагментов ДНК. К 5’-концу, т.е. началу фрагмента, присоединяют с помощью специального фермента фосфатную группу, несущую радиоактивный фосфор ³²P. Далее образец делят на четыре части.  

В каждой из порций осуществляют специфические реакции разрыва нити ДНК по месту одного из четырех оснований. С этой целью обычно используют диметилсульфат, гидразин и пиперидин. Проводя несколько таких реакций с разной специфичностью (в отношении оснований, расположенных рядом с данным), получают набор более коротких фрагментов ДНК. Затем все четыре образца разделяют параллельно в аппарате для гель-электрофореза. Гели накладывают на рентгеновскую пленку; на ней отпечатываются те полоски, которые несут ³²P. Непосредственно по радиоавтографам электрофореграмм можно «прочесть» последовательность. За один опыт можно исследовать фрагменты длиной до 300-500 нуклеотидов. Это очень высокая производительность, не достижимая ни одним из других существующих методов. 

Однако необходимо знать, в каком порядке располагаются фрагменты в целой молекуле. С этой целью ДНК «разрезают» с помощью другого набора рестриктаз, получают другой набор фрагментов, а затем вновь определяют в них последовательности нуклеотидов. По перекрыванию последовательностей, полученных при различных способах разрезания, определяют с помощью ЭВМ порядок расположения фрагментов. Этот метод секвенирования, т.е. определения последовательности нуклеотидов в ДНК, назван методом Свердлова-Максама-Гилберта.  

Несколько раньше В. Гилбертом (1975-1976) был предложен метод получения РНК-овых копий с участков ДНК и их последующей расшифровки. При этом используют фермент РНК-полимеразу, которая синтезирует РНК-копии на одиночных цепях ДНК, начиная и кончая синтез в строго определенных местах. Расшифровка получаемых РНК-овых копий облегчается тем, что можно предварительно ввести радиоактивную метку в любое азотистое основание.

Иной путь для такого рода работ предложил Ф. Сэнгер (Англия, 1976-1978): получение ДНК-копий с помощью ДНК-полимеразы и использование минус- и плюс-систем. Метод основан на том, что ДНК-полимераза обладает способностью удлинять затравку (начальный отрезок цепи – праймер), связанную с одноцепочечной матрицей, в результате чего образуются одноцепочечные фрагменты (ДНК-копии). В минус-системе ДНК-копии получаются в четырех вариантах, каждый из которых не содержит какой-либо один вид нуклеотида. При этом синтез цепи обрывается в том месте, где должен следователь отсутствующий нуклеотид. 

В плюс-системе в каждом из четырех вариантов добавляется только один вид нуклеотида из четырех. Восемь полученных проб радиоактивно меченных фрагментов разделяют методом гель-электрофореза. Полученные радиоавтографы дают возможность судить о первичной структуре исследуемой ДНК.  

Известен и другой вариант метода секвенирования путем получения ДНК-копий. В этом случае удлинение затравки осуществляют в присутствии четырех обычных нуклеотидов и одного химического аналога нуклеотида, включение которого в растущую цепь прекращает синтез, так как у налога нет свободной 3’-OH-группы, к которой должен присоединяться следующий нуклеотид. Имея четыре вида аналогов и используя их в определенном отношении с обычными нуклеотидами, можно получать наборы продуктов копирования ДНК-матрицы, имеющие общее начало – праймер – и кончающиеся на нуклеотидах того или иного типа. Разделение этих фрагментов в ПААГ в зависимости от размеров позволяет «прочитать» их последовательность на радиоавтографе. 

Для изучения повторяющихся последовательностей в ДНК эукариот широко применяют метод реассоциации. Используя методы расщепления рестриктазами, химическими агентами, получения РНК-овых копий, минус- и плюс-систем, реассоциации, гель-электрофореза, радиоавтографии, удалось расшифровать первичную структуру ДНК вируса SV40, бактериофагов φX174, fd, а также отдельных участков ДНК эукариот: гена гомона соматостатина, гена тирозиновой тРНК, β-глобинового гена человека и кролика и ряда других. При этом было выяснено, что в молекулах ДНК, выделенных из бактериофагов, почти все последовательности нуклеотидов уникальны, т.е. встречаются один раз. Они несут информацию о последовательности чередования аминокислотных остатков в белках.  

В гораздо более крупных по размерам молекулах ДНК бактерий большинство генов также уникальны. Наряду с этим повторяются по несколько раз гены, кодирующие транспортные РНК и рибосомные РНК. Например, в геноме E. coli содержится примерно 6 участков, кодирующих рибосомные РНК. Среди коротких повторяющихся единиц в хромосомах бактерий и некоторых бактерифагов встречаются IS-элементы (мигрирующие элементы ДНК). 

В геноме высших эукариот ДНК содержится на 3-4 порядка больше, чем у бактерий, в то время как количество разных белков увеличивается не более чем на порядок. Это объясняют как сложной организацией генов, так и наличием повторяющихся участков ДНК.  

Так, в геноме человека около 64% составляют участки ДНК, представленные один или несколько раз (уникальные последовательности). Это – структурные гены, несущие информацию о структуре специфических белков. Остальную ДНК составляют повторяющиеся последовательности. От 1/10 до 1/4 генома животных представлены умеренно повторяющимися последовательностями (от 10 до 10⁴ копий на гаплоидный геном). Сюда относятся структурные гены, которые кодируют продукты, необходимые клетке в больших количествах. Так, гены рибосомных РНК имеются у животных в количестве от 100 до 1000, у человека – от 300 до 600. Многократное повторяются гены, кодирующие транспортные РНК, и гены, кодирующие белки-гистоны, отдельные цепи иммуноглобулинов. Чаще всего они располагаются в ДНК в виде тандемных повторов (от англ. tandem – расположение гуськом, цугом), один ген отделяется от другого спейсером (от англ. spacer – промежуток). По-видимому, на ранних стадиях эмбриогенеза, когда необходима продукция огромных количеств рибосомных РНК и гистонов, один ген не может обеспечить требуемую скорость синтеза. Многочисленные копии генов делают это возможным. 

В группу умеренно повторяющихся последовательностей входят участки ДНК, выполняющие регуляторные функции. К этой же группе относятся гены, которые представлены в виде нескольких копий и могут изредка менять свою локализацию в геноме. Они открыты в дрожжах, у мышей, дрозофил и получили название мобильные диспергированные гены (МДГ).  

В ДНК эукариот существуют также часто повторяющиеся последовательности (повторены сотни тысяч и миллионы раз). В основном это сателлитная ДНК. Ее можно отделить от остальной ДНК и разделить на несколько фракций. С этой целью ДНК расщепляют на двухцепочечные фрагменты длиной в 10 000-60 000 пар нуклеотидов (п.н.), а затем подвергают ультрацентрифугированию  градиенте CsCl. В этих условиях ДНК распределяется в основной полосе и в наборе меньших полос, называемых сателлитами (от лат. satellitis – спутник, сопровождающий). 

Сателлитные ДНК обычно имеют очень простую многократно повторяющуюся последовательность. Например, сателлитная ДНК мыши содержит такие часто повторяющиеся последовательности: 5’ГАААААТГА-3’ и 3’-ТТТТТАЦТ-5’. Повторяясь 150-300 раз, они образуют кластеры (скопления), из которых состоит сателлитная ДНК. Одна из общих черт сателлитов – это присутствие в каждой цепи ДНК только трех из четырех возможных оснований. Функции сателлитной ДНК пока неизвестны. Сателлиты обнаруживаются обычно в центромерном герерохроматине и могут, видимо, участвовать в спаривании и расхождении хромосом.  

У человека обнаружены четыре сателлитные ДНК, которые составляют 6% хромосомной ДНК. Из них изучены три – I, II, III. Все они сосредоточены в центромерном хроматине. В каждой хромосоме преобладает какой-либо один сателлит. Единственная хромосома, в которой наряду с центромерным содержится сателлит в дистальной части – Y-хромосома. Участки Y-хромосомы, содержащие высокие концентрации сателлитов, различны у разных индивидуумов, что указывает на наследственный полиморфизм. 

ДНК содержит обращенные повторы, или палиндромы (от греч. палинроме – перевертыш), - последовательности, повторяющиеся в обратном порядке. Последовательность оснований в одной из цепей палиндрома совпадает с последовательностью оснований другой цепи, если прочитывать ее в противоположном направлении. В эукариотических ДНК обнаружены как короткие, так и очень длинные палиндромы. Находясь в линейной ДНК, «перевертыши» не оказывают влияния на ее вторичную структуру. Если же ДНК приобретает сверхспирализованную конформацию, то длинные палиндромы (10-20 и более пар оснований), складываясь, образуют крестообразные структуры. Предполагают, что последние могут служить сигналами для узнавания определенных участков ДНК ферментами (рестриктазами, метилазами) и белками, регулирующими действие генов. 

Анисимов А.А. Основы биохимии. Стр. 185-190.