Физико-химические свойства ДНК

Хромосомы животных, бактерий, вирусов, содержат по одной непрерывной ДНК-спирали огромной длины по сравнению с размерами ядра. Молекулярная масса ДНК определена с помощью ряда методов. Классический метод ультрацентрифугирования позволяет определять размеры ДНК в пределах M=2•10⁵-1•10⁹. Более длинные молекулы разрываются при ультрацентрифугировании, поэтому их молекулярную массу определяют по вязкости. 

Для определения плотности молекул ДНК широко используют метод равновесного центрифугирования в градиенте CsCl. Если растворы солей цезия (хлористого или сернокислого) центрифугировать при достаточно высоких скоростях, то в поведении молекул возникают две взаимно противоположные тенденции: к седиментации под действием большого ускорения и к хаотической диффузии. При определенных условиях центрифугирования достигается равновесие между этими двумя процессами, в пробирке возникает устойчивый градиент концентрации и, следовательно, плотности. Если в раствор внести молекулы нуклеиновой кислоты, то он будут оседать в градиенте, пока не достигнут области, где плотность солевого раствора будет такой же, как их собственная. Такую плотность называют плавучей. Пользуясь этим методом, можно разделить смесь очень близких по свойствам полимеров на отдельные компоненты. Плавучая плотность ДНК находится в пределах 1,69-1,73. Она зависит от физического состояния и химического состава ДНК. Нативная ДНК имеет меньшую плавучую плотность, чем денатурированная, и это свойство используют для разделения одно- и двухцепочечных молекул. Установлена зависимость плавучей плотности ДНК от нуклеотидного состава: для нативной ДНК в нейтральном растворе CsCl плавучая плотность пропорциональна содержанию Г + Ц в пределах от 20 до 80%. При использовании в качестве стандарта ДНК E. coli с плотностью 1,71 г•см-3 была выведена эмпирическая формула: плавучая плотность = 1,660 + 0,098 (Г + Ц в молярных долях). По ней можно рассчитать Г + Ц в процентах, т.е. определить нуклеотидный состав ДНК. Используя метод центрифугирования в градиенте CsCl, можно также отделить многократно повторяющиеся последовательности нуклеотидов от остальной ДНК. 

Все внешние факторы, которые нарушают водородные связи или ослабляют стэкинг-взаимодействия, вызывают денатурацию ДНК. К ним относятся реагенты, подобные формамиду и мочевине, резкое изменение pH и ионной силы раствора, повышение температуры выше 80°C. Денатурация ДНК – это любые изменения пространственного расположения цепей ДНК без разрыва ковалентных связей. Обычно при денатурации происходит нарушение водородных связей, или стэкинг-взаимодействий, или тех и других. Двойная спираль ДНК при этом полностью или частично разделяется на составляющие ее цепи.  

Для оценки перехода ДНК от нативного состояния к денатурированному используют ряд методов. Чаще всего измеряют поглощение в УФ-области. Интенсивность поглощения света пуриновыми и пиримидиновыми основаниями в расчете на одно основание зависит от того, присутствует ли оно в свободном состоянии или входит в состав полинуклеотидов. При образовании двухспиральной структуры ДНК поглощение света каждым основанием уменьшается (явление гипохромизма). Разрушение двухцепочечной структуры при денатурации уменьшает «экранированность» оснований, интенсивность поглощения УФ-света возрастает. Если относительное поглощение при 260 нм отложить по оси ординат, а температуру – по оси абсцисс, то получается S-образная кривая (профиль плавления). 

Она показывает, что при нагревании ДНК ведет себя подобно кристаллам: двухцепочечная молекула «расплетается» на составляющие ее цепи в пределах небольшого температурного интервала. Поэтому денатурацию ДНК нередко называют плавлением, а температуру, при которой ДНК денатурирована на 50%, – температурой плавления – T_пл. S-образные профили плавления показывают, что денатурация ДНК – кооперативный процесс, т.е. каждое предшествующее изменение повышает вероятность последующего. Например, в результате внешнего воздействия разрывается несколько водородных связей между азотистыми основаниями, это приводит к нарушению стэкинг-взаимодействий, что облегчает разрыв следующих водородных связей, и т.д.; этот процесс можно сравнить с расстегиванием молнии.  

Температуры плавления и профили плавления разных ДНК отличаются. Например, ДНК человека имеет T_пл=81-82°C, а ДНК E. coli 90,5°C. Температура плавления ДНК зависит от соотношения азотистых оснований (Г + Ц) и (А + Т). ГЦ-пары более прочные (содержат три водородные связи), поэтому чем больше содержание (Г + Ц), тем выше температура плавления. При стандартных условиях (определенные pH и ионная сила) T_пл возрастает на 1% при увеличении молярной доли ГЦ-пар на 2,5%. Таким образом, измеряя температуру плавления, можно точно определить соотношение в ДНК (Г + Ц) и (А + Т) нуклеотидов. Выведена эмпирическая зависимость между ГЦ-содержанием и T_пл в стандартном солевом растворе (0,015 M NaCl + 0,015 M цитрата натрия), это соотношение выглядит так: Г + Ц = (T_пл-69,3)*2,44. 

Полная денатурация ДНК – это расхождение комплементарных цепей. При быстром охлаждении раствора денатурированной ДНК цепи остаются в разделенном состоянии. Однако если охлаждение проводить медленно, поддерживая в течение некоторого времени температуру немного ниже T_пл (этот прием называют отжигом), может восстановиться нативная структура. Восстановление первоначальной структуры нуклеиновой кислоты с более или менее полным восстановлением физических показателей и биологических свойств получило название ренатурации. Это процесс, противоположный денатурации.  

Степень сплавляемости молекул ДНК разных видов характеризует и степень их гомологии. Это используют для решения проблем таксономии бактерий: проводят молекулярную гибридизацию, т.е. процесс ренатурации, но с цепями ДНК, принадлежащими разным, хотя и родственным, бактериям. Гомологию испытуемых молекул можно охарактеризовать количественно. 

Р. Бриттен и Э. Дэвидсон применили метод реассоциации к изучению организации генома эукариот. С этой целью ДНК разделяют на фрагменты и плавят, т.е. получают одноцепочечные фрагменты. Затем изучают кинетику реассоциации: скорость поиска комплементарных партнеров. Изучение скорости восстановления двухспиральных фрагментов показало, что ДНК высших организмов очень гетерогенна: от очень медленно реассоциирующихся фрагметнтов, которые должны соответствовать уникальным участкам генома, до очень быстро реассоциирующихся фрагментов. Быстрая реассоциация показывает, что данная последовательность повторяется в геноме многократно. Этим методом была количественно охарактеризована степень повторяемости нуклеотидных последовательностей в геноме эукариот.  

Искусственным путем можно получить гибрид ДНК-РНК: молекулы матричной РНК (мРНК) гибридизуются с одной из двух разделившихся цепей ДНК, несущей участки, комплементарные мРНК. Измеряя в процентах количество связавшейся мРНК белка, кодируемого исследуемой ДНК, можно определить частоту повторов данного гена. Растворы нативной ДНК имеют высокую вязкость, которая резко понижается при денатурации. Поэтому измерение вязкости также можно использовать для определения состояния молекул ДНК. 

Резкое подкисление или подщелачивание разрушает двухспиральную структуру ДНК, так как изменяется ионизация амино- и кетогрупп азотистых оснований, вследствие чего разрываются водородные связи. Растворы нативной ДНК оптически активны, обладают сильным правым вращением поляризованного света, которое уменьшается при денатурации.  

Денатурация и ренатурация ДНК непрерывно протекают в клетке в процессе репликации ДНК, в процесс транскрипции. Проведение их в лаборатории позволяет изучать многие свойства молекул ДНК. 

Анисимов А.А. Основы биохимии. Стр. 193-196.